About this video

• Video Title: Seminario 11 Técnicas de Biología Molecular aplicadas a Entidades Monogénicas - Sebastián Giusti
• Channel: Biología Molecular y Genética FMED - UBA
• Speakers: Sebastián Giusti
• Duration: 01:16:53

Overview

This video explains various molecular biology techniques used in medical genetics, focusing on detecting allelic variants in the genome. It covers PCR and its variations, DNA sequencing methods, and their applications in diagnosing genetic disorders, forensic science, and understanding genetic diversity.

Key takeaways

• PCR Fundamentals: The video details the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique, its components (DNA template, Taq polymerase, dNTPs, primers), and the three-step cycle (denaturation, annealing, elongation) leading to exponential DNA amplification.
• PCR Applications: It explores how PCR is used to detect insertions/deletions (e.g., cystic fibrosis), point mutations (using allele-specific PCR or PCR-RFLP), and repeat expansions (TPPCR).
• DNA Sequencing: The lecture introduces DNA sequencing methods, starting with Frederick Sanger's method and progressing to next-generation sequencing (NGS) and high-throughput sequencing, explaining their use in determining nucleotide order and identifying genetic variations across an individual's genome.
• Forensic and Diagnostic Uses: Specific applications like multiplex PCR for forensic analysis (determining relatedness) and TPPCR for diagnosing triplet expansion diseases are discussed, highlighting their importance in medical genetics and diagnostics.
• Interpreting Results: The video emphasizes the importance of analyzing results from techniques like gel electrophoresis and electropherograms to understand an individual's genetic makeup and potential health implications.

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Guía de Estudio: Seminario 11 - Técnicas de Biología Molecular aplicadas a Entidades Monogénicas

Profesor: Sebastián Giusti Canal: Biología Molecular y Genética FMED - UBA Duración: 01:16:53

Introducción:

Este seminario explora las técnicas de biología molecular fundamentales para la genética médica, con el objetivo de detectar variantes alélicas en nuestro genoma. Se divide en dos partes principales: técnicas basadas en PCR y técnicas basadas en secuenciación de ADN. Ambas buscan comprender los fundamentos moleculares y el contexto clínico de su aplicación.

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Parte 1: Técnicas basadas en PCR

1. Fundamentos de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa):

• Concepto: Técnica desarrollada por Kary Mullis (Premio Nobel 1993) que permite la amplificación de un segmento específico de ADN a partir de una mezcla compleja.
• Mecanismo: Reproduce una reacción química de polimerización de ácidos nucleicos.
• Componentes Clave:
  • ADN molde: ADN genómico extraído del paciente.
  • ADN Polimerasa: Enzima termorresistente (ej. Taq polimerasa).
  • dNTPs: Desoxirribonucleótidos (Adenina, Timina, Citosina, Guanina), sustratos para la polimerasa. Se usan en gran exceso.
  • Primers (Cebadores): Segmentos cortos de ADN (u ARN) que determinan la región a amplificar y proporcionan un extremo 3'-OH libre para iniciar la polimerización.
  • Buffer: Solución amortiguadora para mantener el pH estable.
  • Cationes divalentes (Mg²⁺): Cofactor esencial para la ADN polimerasa.
• Requerimientos de la ADN Polimerasa:
  • Necesita un molde de ADN de cadena simple.
  • No puede sintetizar de novo; requiere un extremo 3'-OH libre en una hebra preexistente para extenderla.
• Función de los Primers:
  • Proporcionan el extremo 3'-OH libre necesario para la polimerasa.
  • Definen la especificidad de la región a amplificar. Se usan al menos dos primers (forward y reverse) que flanquean el segmento deseado.
• Ciclos de Amplificación: La reacción consta de ciclos repetitivos con tres pasos:
  1. Desnaturalización (aprox. 95°C): Separa las hebras de ADN doble cadena.
  2. Hibridación/Alineamiento (aprox. 50-70°C): Los primers se unen a las hebras molde. La temperatura depende de la composición de los primers.
  3. Elongación/Extensión (aprox. 72°C): La Taq polimerasa sintetiza nuevas hebras de ADN.
• Resultado: Amplificación exponencial de la región diana. Después de ~30 ciclos, se obtienen miles de millones de copias del fragmento deseado.
• Visualización de Productos:
  • Electroforesis en gel: Separa fragmentos de ADN por tamaño. Las moléculas de ADN, cargadas negativamente, migran en un gel (matriz porosa) hacia el polo positivo. Fragmentos más pequeños migran más rápido.
  • Tinción: Se usa un intercalante de ADN como bromuro de etidio (o SYBR Safe), que emite fluorescencia bajo luz UV.
  • Marcadores de peso molecular: Permiten estimar el tamaño de los fragmentos amplificados.
  • Electroforesis capilar: Alternativa a la electroforesis en gel, usa un capilar y un detector para visualizar los fragmentos como picos en un electroferograma.

2. Variantes de la PCR para el Diagnóstico de Entidades Monogénicas:

• PCR Convencional para Detección de Inserciones/Deleciones:
  • Se diseñan primers flanqueantes a la región de interés.
  • Si hay una inserción o deleción, los productos de amplificación (amplicónes) tendrán tamaños diferentes.
  • Ejemplo: Fibrosis Quística (deleción F508del en el gen CFTR). La diferencia de tamaño (3 nucleótidos) se puede visualizar en geles de poliacrilamida.
  • Genotipo: Homocigota sin deleción (amplicón más grande), homocigota con deleción (amplicón más pequeño), heterocigota (dos bandas de diferente tamaño).
• PCR Aleloespecífica (AS-PCR):
  • Detecta mutaciones puntuales (sustituciones).
  • Se diseña un primer cuya extremidad 3' se aparea específicamente con una variante alélica (normal o mutada).
  • Si el apareamiento es perfecto, la polimerasa extiende el primer y se produce amplificación. Si hay un mal apareamiento en el extremo 3', la amplificación es ineficiente o nula.
  • Usualmente se necesitan dos reacciones separadas (una para cada alelo) o un diseño más complejo para determinar el genotipo completo.
• PCR RFLP (Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos de Restricción):
  • Combina PCR con enzimas de restricción.
  • Se amplifica un fragmento que contiene una mutación puntual.
  • Luego, se trata el producto de PCR con una enzima de restricción que reconoce una secuencia específica.
  • Si la mutación afecta el sitio de reconocimiento de la enzima, la enzima no podrá cortar el ADN.
  • La diferencia en el tamaño de los fragmentos (cortados vs. no cortados) se visualiza por electroforesis, permitiendo determinar el genotipo.
• PCR Multiplex (Aplicación Forense):
  • Se utilizan múltiples pares de primers en una sola reacción para amplificar simultáneamente varias regiones polimórficas (ej. STRs - Short Tandem Repeats o microsatélites).
  • Los productos se visualizan típicamente por electroforesis capilar, usando fluoróforos de diferentes colores para distinguir los amplicones.
  • Permite generar un "perfil genético" para establecer relaciones biológicas (filiación) o identificación.
• TPPCR (Triple Prime PCR):
  • Diseñada para detectar enfermedades por expansión de tripletes (ej. FMR1).
  • Utiliza tres primers: uno forward flanqueante, un reverse flanqueante y un tercer primer que se une a la región de repetición.
  • Permite detectar alelos normales, premutados y mutados patogénicos, diferenciando el tamaño y la eficiencia de amplificación de los productos.
  • Los resultados se analizan por electroforesis capilar, observando patrones de picos característicos para cada rango de expansión.

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Parte 2: Técnicas basadas en Secuenciación de ADN

1. Método de Secuenciación de Sanger:

• Concepto: Desarrollado por Frederick Sanger (Premio Nobel 1980), determina el orden de los nucleótidos en un fragmento de ADN.
• Principio Molecular: Se basa en la terminación de la polimerización de ADN in vitro. Se utilizan dNTPs normales y pequeñas cantidades de dideoxinucleótidos (ddNTPs).
• Dideoxinucleótidos (ddNTPs): Carecen del grupo 3'-OH en el azúcar. Cuando se incorporan a una cadena de ADN en crecimiento, impiden la adición de nucleótidos posteriores, terminando la elongación.
• Procedimiento:
  • Una reacción de polimerización in vitro incluye ADN molde, ADN polimerasa, dNTPs normales, un primer (sintético o unido a una secuencia conocida añadida al molde) y una mezcla de los cuatro tipos de ddNTPs.
  • Cada tipo de ddNTP (ddA, ddT, ddC, ddG) está marcado con un fluoróforo diferente.
  • Debido a la baja concentración de ddNTPs, se generan millones de fragmentos de ADN de diferentes longitudes, cada uno terminando en una posición específica y marcada con un color particular.
• Análisis: Los fragmentos se separan por electroforesis capilar. Un detector lee la fluorescencia de cada fragmento a medida que pasa, determinando el nucleótido terminal y su posición.
• Resultado: Un electroferograma muestra picos de fluorescencia de diferentes colores, representando la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN.
• Limitaciones: Secuencia una única molécula por experimento, es costoso y relativamente lento para grandes genomas. Se usa para genes específicos o regiones de interés.

2. Secuenciación de Alto Rendimiento (Next-Generation Sequencing - NGS):

• Concepto: Metodologías que permiten secuenciar millones de fragmentos de ADN en paralelo.
• Ventajas: Mayor velocidad, menor costo por base y capacidad para secuenciar genomas completos o exomas (regiones codificantes) de forma eficiente.
• Proceso General: Extracción de ADN -> Fragmentación -> Secuenciación de fragmentos en paralelo -> Análisis bioinformático (alineamiento con un genoma de referencia) para identificar variantes.
• Aplicación: Identificación de variantes genéticas en el genoma completo, útil cuando no hay una hipótesis clínica fuerte sobre el gen implicado.
• Desafío: La gran cantidad de variantes encontradas requiere análisis bioinformático y correlación clínica para determinar cuáles son patogénicas.

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Contextualización y Aplicaciones Clínicas:

• Diagnóstico Molecular de Enfermedades Monogénicas:
  • Sin hipótesis fuerte: Se usa secuenciación de alto rendimiento (NGS) para explorar todo el genoma o exoma.
  • Con hipótesis (gen conocido):
    • Si se sospecha una inserción/deleción: PCR convencional.
    • Si se sospecha una sustitución puntual: PCR aleloespecífica o PCR-RFLP.
    • Si se sospecha expansión de tripletes: TPPCR.
    • Secuenciación de Sanger para confirmar o analizar genes específicos.
• Genética Forense: PCR multiplex para análisis de STRs e identificación de individuos o relaciones de parentesco.
• Importancia: Estas técnicas son cruciales para el diagnóstico preciso, la consejería genética y el desarrollo de terapias dirigidas.

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Conclusión:

Las técnicas de biología molecular, desde la clásica PCR hasta la avanzada secuenciación de nueva generación, ofrecen herramientas poderosas para comprender la base genética de las enfermedades y aplicarlas en diversos campos como la medicina y la ciencia forense.

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