About this video

• Video Title: Seminario 21 Variación numero de copias y técnicas de FISH, MLPA, y CGH ARRAY - Roxana Cerretini
• Channel: Biología Molecular y Genética FMED - UBA
• Speakers: Roxana Cerretini
• Duration: 01:39:20

Overview

This video lecture by Roxana Cerretini explains the concept of copy number variation (CNV) in the genome, detailing its impact on gene expression and potential pathogenicity. It also covers various techniques used to detect CNVs, including FISH, MLPA, and CGH array, comparing their methodologies, resolutions, and applications.

Key takeaways

• Copy Number Variation (CNV): CNVs are structural variations in the genome where differences in the number of copies of DNA segments exist between individuals of the same species. They can occur in intronic, non-coding, or coding regions and can affect gene regulation or protein production, potentially leading to neutral effects or pathogenicity depending on gene dosage sensitivity.
• Distinction from SNPs: CNVs differ from Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in size and impact. SNPs involve a single nucleotide change and are generally less impactful individually, often related to complex, multifactorial diseases, while CNVs involve larger segments of DNA and can have more significant consequences.
• Classification of CNVs: The American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) classifies CNVs into five categories: benign, likely benign, uncertain significance, likely pathogenic, and pathogenic, based on population frequency, functional data, and clinical evidence.
• Formation Mechanisms: CNVs can arise from errors in homologous recombination (non-allelic or allelic), replication errors (fork collapse or polymerase slippage), and DNA double-strand break repair mechanisms (non-homologous end joining or microhomology-mediated end joining).
• Detection Techniques:
  • CGH Array: A genome-wide technique ideal for detecting large copy number gains or losses across the entire genome, useful for cases with unknown etiology.
  • MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification): A more targeted technique used to detect copy number variations in specific genes or regions when there's a clinical suspicion, offering higher resolution within genes.
  • FISH (Fluorescence In Situ Hybridization): A cytomolecular technique that uses fluorescently labeled probes to detect specific DNA sequences on chromosomes, capable of identifying both balanced and unbalanced rearrangements but is typically directed and detects only the targeted region.

Claro, aquí tienes un resumen en español del seminario, estructurado para una guía de estudio en formato PDF:

---

Guía de Estudio: Variación del Número de Copias y Técnicas de Detección

Seminario 21 | Roxana Cerretini | Biología Molecular y Genética FMED - UBA

---

I. Introducción a la Variación del Número de Copias (CNV)

• Definición: La variación del número de copias (CNV, por sus siglas en inglés Copy Number Variation) es un tipo de variación estructural en el genoma que implica diferencias en la cantidad de copias de segmentos o regiones de ADN entre individuos de una misma especie.
• Ejemplo Ilustrativo: Se presenta un ejemplo donde diferentes individuos tienen un número variable de repeticiones en una región específica del ADN (ej. 3 copias, 5 copias en un alelo y 1 en el otro, etc.).
• Características:
  • Son variantes frecuentes en la población.
  • Son altamente polimórficas (variables entre individuos).
  • Pueden localizarse en regiones:
    • Intrónicas o no codificantes: Cercanas a promotores o secuencias enhancer/silenciadoras.
    • Codificantes: Afectando directamente la estructura del gen.
  • Pueden tener dos copias, tres copias, cuatro copias de un gen.
• Impacto Funcional:
  • Pueden afectar la regulación de la expresión génica.
  • Pueden ser neutras o producir patogenicidad.
  • La patogenicidad depende de la sensibilidad a la dosis génica. Si un gen es sensible a la dosis, tener un número alterado de copias puede llevar a un fenotipo anómalo o patología.

II. Diferencias Clave: CNV vs. SNP

• SNP (Polimorfismo de Nucleótido Único):
  • Cambio de un solo nucleótido por otro en una posición específica del genoma.
  • Menos frecuente (0.1% del genoma nos diferencia, incluyendo SNPs y CNVs).
  • Hay aproximadamente 4-5 millones de SNPs.
  • Alta frecuencia poblacional (>1%).
  • Relacionados principalmente con enfermedades poligénicas multifactoriales (enfermedades comunes del adulto). Cada SNP aporta una "fuerza" en términos de riesgo, y el efecto combinado de varios SNPs puede aumentar el riesgo o ser protector.
• CNV:
  • Implica diferencias en el número de copias de segmentos de ADN más grandes.
  • Tamaño: Varía desde menos de 1 kilobase hasta decenas de megabases. Se considera CNV a partir de 50 pares de bases.
  • Frecuencia poblacional: El 10-15% del genoma presenta CNVs.
  • Impacto: Pueden ser neutros o patogénicos, dependiendo de la sensibilidad a la dosis génica.
  • Asociados a trastornos del neurodesarrollo (espectro autista, epilepsia, esquizofrenia) y susceptibilidad al cáncer.

III. Características y Mecanismos de Formación de CNVs

• Características:

  • Alteraciones estructurales que resultan en un número variable de copias.
  • Pueden ser pérdidas (deleciones) o duplicaciones (ganancias) de segmentos genómicos.
  • Pueden ser repeticiones múltiples o combinaciones de deleciones y duplicaciones.
  • Tamaño: Oscila entre <1 kb hasta decenas de megabases.

• Mecanismos de Formación:

  1. Recombinación Homóloga No Alélica (Desalineada):
     • Ocurre entre secuencias homólogas, pero desalineadas (ej. regiones repetitivas).
     • Frecuente en meiosis I (intercromosómica).
     • Puede resultar en cromosomas duplicados y delecionados.
     • También puede ocurrir intracromosómicamente en meiosis II, generando cromátides delecionadas/duplicadas.
     • Puede resultar en cromosomas en anillo y cromosomas delecionados (intracromatídica).
  2. Errores en la Recombinación Homóloga (Alélica):
     • Recombinación homóloga normal, pero con errores durante el crossing over en meiosis I, resultando en ganancia en un cromosoma y pérdida en el otro.
  3. Errores Durante la Replicación del ADN:
     • Colapso de horquilla de replicación (FOSTeS): Ocurre en fase S de la mitosis. La horquilla se detiene (por rotura, estrés, etc.), la hebra rezagada busca otras horquillas activas y continúa la replicación, generando zonas duplicadas o delecionadas en el mismo cromosoma.
     • Deslizamiento de la ADN polimerasa (Slippage): Ocurre en fase S de la mitosis en zonas repetitivas. La polimerasa puede volver a copiar una región (expansión/duplicación) o saltarse una región (deleción).
  4. Errores en la Reparación de Roturas de Doble Hebra:
     • Unión de Extremos No Homólogos (NHEJ): Une extremos rotos sin homología, pudiendo generar deleciones, duplicaciones o inserciones. Opera en G1, S, G2 del ciclo celular.
     • Reparación Mediada por Microhomología (MMEJ): Similar a NHEJ, pero utiliza pequeñas secuencias homólogas para alinear los extremos rotos, pudiendo generar deleciones y duplicaciones.

• Factores que Facilitan la Formación de CNVs:

  • Presencia de secuencias repetitivas (elementos Alu, L1, low copy repeats).
  • Fragilidad genómica en ciertas regiones.
  • Condiciones celulares: Estrés oxidativo, replicativo, mecánico.

IV. Clasificación de CNVs (ACMG)

La clasificación sigue criterios estandarizados para describir la probabilidad de asociación con enfermedades:

1. Benignas: Sin impacto clínico. Variantes normales dentro del polimorfismo poblacional.
   • Criterios: Alta frecuencia poblacional en individuos sanos, no afecta genes ni regiones críticas, estudios funcionales/epidemiológicos indican ausencia de asociación.
2. Probablemente Benignas: Baja probabilidad de impacto clínico. Se manejan clínicamente como benignas.
   • Criterios: Baja frecuencia en poblaciones sanas, pero sin evidencia fuerte de patogenicidad. Localización en regiones de impacto funcional incierto.
3. De Significado Incierto (VUS): No hay suficiente evidencia para clasificarlas como benignas o patogénicas.
   • Criterios: Escasa información o datos contradictorios en bases de datos/literatura. Localización en genes/regiones de función no del todo conocida. Conflictos en estudios funcionales/poblacionales/clínicos.
   • Determinación futura: Pruebas funcionales y datos epidemiológicos contundentes determinarán si se clasifican como benignas o patogénicas.
4. Probablemente Patogénicas: Alta probabilidad de estar asociadas a una condición clínica/enfermedad, pero sin evidencia concluyente. Se manejan clínicamente como patogénicas.
   • Criterios: Baja frecuencia poblacional. Localización en genes conocidos asociados a enfermedad.
5. Patogénicas: Evidencia sólida y concluyente de asociación con enfermedad.
   • Criterios: Baja frecuencia poblacional (extremadamente baja en sanos). Presencia consistente con una enfermedad específica. Pruebas funcionales claras y contundentes demuestran relación causal.

V. Técnicas para el Estudio de CNVs

• Limitaciones de Secuenciación Sanger/PCR: No son adecuadas para detectar CNVs extensas (>1000 pb) debido al límite de amplificación. Solo detectarían el alelo normal si uno está alterado.

1. CGH Array (Hibridación Genómica Comparativa por Microarrays):

   • Principio: Compara la cantidad de ADN de una muestra (paciente) con una muestra control normal. Se marcan ambos ADN con fluoróforos diferentes (ej. paciente rojo, control verde) y se hibridan sobre una plataforma con secuencias de ADN representativas de todo el genoma. La intensidad de fluorescencia en cada punto indica si hay ganancia (más color del paciente) o pérdida (más color del control).
   • Aplicaciones: Estudio global del genoma para detectar desbalances (ganancias/pérdidas). Ideal para desórdenes del neurodesarrollo, discapacidad intelectual, dismorfias, cuando la causa es desconocida.
   • Ventajas: Analiza todo el genoma en un solo experimento, no requiere células en división, alta resolución (detecta alteraciones en el rango de kilobases). Mayor resolución que el cariotipo.
   • Limitaciones: No detecta reordenamientos balanceados (translocaciones, inversiones). No permite determinar el mecanismo de formación de la CNV. Detecta mal mosaicos bajos. Requiere ADN de alta calidad.

2. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification):

   • Principio: Técnica de PCR multiplex que utiliza pares de sondas específicas para amplificar simultáneamente varias regiones o genes diana. Una ligasa une las sondas solo si se unen perfectamente al ADN. La longitud variable de una secuencia (stuffer) en una de las sondas permite la amplificación de fragmentos de diferente tamaño, que se separan por electroforesis capilar y se cuantifican. La comparación con controles permite determinar ganancias o pérdidas de copias en las regiones estudiadas.
   • Aplicaciones: Estudio dirigido de CNVs en genes o regiones específicas cuando hay una sospecha clínica previa (ej. genes BRCA1/2, región 22q11, cáncer hereditario). Es el "gold standard" para confirmar CNVs asociadas a enfermedades conocidas.
   • Ventajas: Alta especificidad y resolución (permite detectar deleciones/duplicaciones de exones individuales). Menos costoso y más rápido que CGH array para estudios dirigidos. Análisis de datos más sencillo.
   • Limitaciones: Solo analiza las regiones para las cuales se diseñaron las sondas. No es un análisis global del genoma.

3. FISH (Hibridación In Situ Fluorescente):

   • Principio: Utiliza sondas de ADN cortas, marcadas con fluoróforos, que hibridan por complementaridad de bases a secuencias específicas en el ADN de muestras biológicas (en metafase o núcleos interfásicos). La presencia de fluorescencia indica la localización de la secuencia diana.
   • Aplicaciones: Confirmación de reordenamientos sospechados por citogenética o detectados por otras técnicas. Detección dirigida de CNVs o reordenamientos específicos.
   • Ventajas: Puede detectar reordenamientos balanceados y desbalanceados. Resolución de 100 kb a 1 Mb. Puede usarse en metafases (para ver la estructura del cromosoma) o núcleos interfásicos (para contar copias).
   • Limitaciones: Es dirigido, solo detecta lo que se busca con la sonda específica. Requiere cultivo celular. La resolución es menor que MLPA o CGH array para CNVs.

VI. Comparativa de Técnicas y Variantes

• CGH Array vs. MLPA:
  • CGH Array: Global, no dirigido, detecta grandes cambios, útil para etiologías desconocidas.
  • MLPA: Dirigido, alta resolución a nivel de exón, confirma sospechas clínicas.
• Variantes:
  • SNP Array (variante de CGH Array): Detecta SNPs y permite estudiar disomías uniparentales e imprinting.
  • MLPA sensible a metilación: Analiza patrones de metilación (análisis epigenético).
• Resolución Comparativa:
  • Citogenética Convencional: >5-10 Mb
  • FISH: 100 kb - 1 Mb
  • CGH Array: 10-50 kb
  • MLPA: Nivel de exón
  • NGS (Secuenciación de Nueva Generación): 1 par de bases (no cubierto en detalle en este seminario).

---