About this video

• Video Title: Seminario 2A: técnicas utilizadas para el estudio de proteínas- Gabriel Scicolone
• Channel: Biología Molecular y Genética FMED - UBA
• Speakers: Gabriel Scicolone
• Duration: 01:31:09

Overview

This video seminar, presented by Gabriel Scicolone, focuses on the techniques used to study proteins. It covers methods for detecting, characterizing, quantifying, localizing, and understanding protein functions. The presentation is divided into two parts, with this session focusing on protein analysis techniques, including immunochemistry, immunofluorescence, Western blot, flow cytometry, and proteomics.

Key takeaways

• Protein Analysis Techniques: The seminar introduces various methods for studying proteins, categorizing them by whether they preserve cellular structure or analyze homogenized samples.
• Antigen-Antibody Interaction: A core principle discussed is the use of the antigen-antibody reaction as the basis for many protein detection techniques like immunochemistry and Western blot.
• Immunochemistry and Immunofluorescence: These techniques are detailed for localizing specific proteins within tissues or cells using labeled antibodies, with explanations of direct and indirect methods.
• Western Blot (Immunoblot): This technique is explained for detecting the presence, relative quantity, and molecular weight of specific proteins in a sample, using gel electrophoresis and antibody-based detection.
• Flow Cytometry: This method is presented as a way to analyze and sort cells based on their physical and chemical characteristics, often utilizing fluorescently labeled antibodies to identify specific cell populations.
• Proteomics: This broad field encompasses techniques that analyze the entire set of proteins expressed by a biological system, with mass spectrometry being a central tool for identification and quantification.

Claro, aquí tienes un resumen del seminario en español, estructurado para una guía de estudio en formato PDF:

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Guía de Estudio: Técnicas para el Análisis de Proteínas

Presentador: Gabriel Scicolone Canal: Biología Molecular y Genética FMED - UBA Duración: 01:31:09

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1. Introducción y Objetivos del Seminario

• Tema Central: Técnicas para el estudio de proteínas y ácidos nucleicos.
• Enfoque de esta Parte (2A): Técnicas para detectar, caracterizar, cuantificar, localizar y estudiar las funciones de las proteínas.
• Clasificación de Técnicas:
  • Según la obtención de muestras (conservando estructura vs. sin conservar estructura).
  • Según la relación con la expresión génica (ADN, ARN, proteínas).

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2. Bases Moleculares: El Anticuerpo y el Antígeno

• Antígeno: Cualquier compuesto (generalmente macromolécula o microorganismo) que, al ser introducido en un organismo, produce una respuesta inmune. Puede ser una bacteria, un virus o una proteína.
• Respuesta Inmune y Anticuerpos:
  • Las células presentadoras de antígeno y los linfocitos reconocen al antígeno.
  • Los linfocitos B producen anticuerpos específicos.
  • Los anticuerpos tienen una porción variable (que reconoce el antígeno específico) y una porción constante.
  • Los linfocitos B activados proliferan y se diferencian en células de memoria y plasmocitos, los cuales secretan anticuerpos.
• Anticuerpo: Glicoproteína formada por cuatro cadenas polipeptídicas (dos largas, dos cortas), cada una con porción constante y variable.
• Determinante Antigénico (Epítopo): La porción específica del antígeno que es reconocida por la porción variable de un anticuerpo. Un antígeno puede tener múltiples epítopos.

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3. Tipos de Anticuerpos

• Anticuerpos Policlonales:
  • Se obtienen al inyectar un antígeno en un animal (ej. conejo).
  • El animal produce anticuerpos contra varios epítopos del mismo antígeno.
  • Provienen de distintos clones de linfocitos B y plasmocitos.
  • Se obtienen del suero del animal (plasma tras precipitar glóbulos).
• Anticuerpos Monoclonales:
  • Dirigidos contra un único determinante antigénico.
  • Se producen fusionando linfocitos B (de un animal inmunizado, ej. ratón) con células tumorales para crear hibridomas.
  • Los hibridomas son inmortales y producen un solo tipo de anticuerpo específico.
  • Se obtienen del sobrenadante del medio de cultivo de los hibridomas.

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4. Técnicas de Inmunodetección (Basadas en Reacción Antígeno-Anticuerpo)

• Inmunoistoquímica (IHQ) / Inmunocitoquímica (ICC):

  • Propósito: Localizar y visualizar la distribución de una proteína específica (antígeno) dentro de un tejido (IHQ) o célula (ICC).
  • Proceso:
    1. Fijación y corte de la muestra (tejido o células).
    2. Incubación con un anticuerpo primario (monoclonal o policlonal) que reconoce la proteína de interés.
    3. Lavado para eliminar anticuerpos no unidos.
    4. Inmunohistoquímica Directa: El anticuerpo primario está marcado con un colorante o fluorocromo.
    5. Inmunohistoquímica Indirecta: Se utiliza un anticuerpo secundario (marcado) que reconoce al anticuerpo primario. Esto permite amplificación de la señal.
  • Detección:
    • Colorimétrica: El anticuerpo marcado tiene una enzima (ej. peroxidasa de rábano) que reacciona con un sustrato, produciendo un color (ej. marrón). Se visualiza con microscopio óptico.
    • Fluorescencia (Inmunofluorescencia - IF): El anticuerpo marcado tiene un fluorocromo que emite luz al ser excitado. Se visualiza con microscopio de fluorescencia.
  • Microscopía Confocal: Técnica avanzada de IF que permite obtener imágenes de planos específicos, mejorando la resolución y localización 3D.

• Western Blot (Inmunoblot):

  • Propósito: Detectar la presencia, determinar el peso molecular y estimar la cantidad relativa de una proteína específica en una muestra (homogenato de tejido, plasma, etc.). No proporciona información sobre la localización celular o tisular.
  • Pasos:
    1. Obtención y Preparación de la Muestra: Homogeneización de tejido o uso de plasma. Las proteínas se desnaturalizan y cargan negativamente (ej. con SDS).
    2. Electroforesis en Gel (SDS-PAGE): Separación de proteínas por peso molecular en un gel de poliacrilamida bajo influencia de un campo eléctrico.
    3. Transferencia (Blotting): Transferencia eléctrica de las proteínas separadas del gel a una membrana sólida (ej. nitrocelulosa o PVDF).
    4. Inmunodetección:
       • Bloqueo de la membrana para evitar uniones inespecíficas.
       • Incubación con un anticuerpo primario contra la proteína de interés.
       • Lavado.
       • Incubación con un anticuerpo secundario marcado (ej. con enzima o fluorocromo).
       • Lavado.
       • Adición de sustrato (si es una enzima) para generar una señal detectable (color o luz).
  • Análisis: Identificación de bandas en la membrana. La presencia de una banda indica la presencia de la proteína. Su posición indica el peso molecular (comparado con estándares). La intensidad de la banda da una idea de la cantidad relativa.

• Citometría de Flujo:

  • Propósito: Analizar y separar células individuales basándose en sus características morfológicas y la presencia de marcadores específicos (proteínas).
  • Proceso:
    1. Las células (a menudo marcadas con anticuerpos fluorescentes contra proteínas de superficie o intracelulares) pasan en un flujo líquido a través de un haz láser.
    2. Detectores miden la luz dispersada (información morfológica: tamaño, granularidad) y la fluorescencia emitida por los marcadores.
  • Aplicaciones: Identificación y cuantificación de poblaciones celulares, separación de células (FACS - Fluorescence-Activated Cell Sorting).

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5. Proteómica

• Propósito: Analizar el conjunto total de proteínas (proteoma) expresadas en un sistema biológico (célula, tejido) en un momento dado, incluyendo su cantidad relativa.
• Herramienta Central: Espectrometría de Masas (MS).
• Proceso General:
  1. Obtención y Homogeneización de la Muestra: Liberación de proteínas del sistema biológico.
  2. Digestión/Fragmentación: Las proteínas se cortan en péptidos más pequeños (ej. usando tripsina).
  3. Separación/Purificación (Opcional pero común): Técnicas como cromatografía líquida o electroforesis bidimensional separan los péptidos o proteínas.
  4. Análisis por Espectrometría de Masas:
     • Los péptidos se ionizan (cargan).
     • Los iones se aceleran y se separan según su relación masa/carga.
     • Se detectan y cuantifican.
  5. Análisis de Datos: Comparación de los espectros de masas obtenidos con bases de datos para identificar las proteínas presentes y estimar sus cantidades relativas.
• Información Obtenida: Identificación de miles de proteínas y sus niveles de expresión, permitiendo comparar proteomas entre diferentes condiciones o muestras.

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6. Resumen Comparativo

Técnica	Fundamento Principal	¿Qué Analiza?	¿Da Localización?	¿Da Peso Molecular?	¿Cantidad Relativa?	Notas Adicionales
Inmunohistoquímica (IHQ)	Reacción Ag-Ac	Proteína específica	Sí (Tejido)	No	No (solo presencia)	Requiere fijación y corte de tejido.
Inmunocitoquímica (ICC)	Reacción Ag-Ac	Proteína específica	Sí (Célula)	No	No (solo presencia)	Para células fijadas o en cultivo.
Inmunofluorescencia (IF)	Reacción Ag-Ac + Fluorocromo	Proteína específica	Sí (Tejido/Célula)	No	No (solo presencia)	Visualización con microscopio de fluorescencia.
Western Blot (WB)	Reacción Ag-Ac + Electroforesis	Proteína específica	No	Sí	Sí	Detecta en muestras homogeneizadas o plasma.
Citometría de Flujo	Inmunofluorescencia + Láser	Células (con marcadores específicos)	Sí (Célula)	No	Sí (poblaciones)	Separa y analiza células individualmente.
Proteómica	Espectrometría de Masas	Conjunto total de proteínas (proteoma)	No (directamente)	Sí (implícito)	Sí	Análisis global de la expresión proteica.

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Este resumen cubre los puntos clave presentados en el seminario, proporcionando una base sólida para el estudio y la comprensión de las técnicas de análisis de proteínas.