About this video

• Video Title: Seminario 2B Técnicas de detección, amplificación y manipulación de ácidos nucleicos - G. Scicolone
• Channel: Biología Molecular y Genética FMED - UBA
• Speakers: Gabriel Cicolone, Sofía Martín
• Duration: 02:34:04

Overview

This video lecture by Gabriel Cicolone and Sofía Martín from Biología Molecular y Genética FMED - UBA covers techniques for detecting, amplifying, and manipulating nucleic acids. It aims to provide a comprehensive understanding of the foundations and applications of these methods in scientific research, medicine, and forensics. The lecture details various techniques including hybridization-based detection (Southern blot, Northern blot, in situ hybridization), amplification (PCR, qPCR), sequencing, and DNA manipulation (recombinant DNA technology, CRISPR-Cas9).

Key takeaways

• Hybridization Techniques: Methods like Southern blot (for DNA) and Northern blot (for RNA) utilize complementary base pairing to detect specific nucleic acid sequences. In situ hybridization allows for the detection of nucleic acids within their cellular or chromosomal context.
• Amplification Techniques (PCR): Polymerase Chain Reaction (PCR) is a crucial technique for amplifying specific DNA segments, enabling detection even from small sample amounts. Real-time PCR (qPCR) allows for quantitative analysis of amplified DNA in real-time using fluorescent signals.
• DNA Manipulation: Recombinant DNA technology involves cutting DNA with restriction enzymes and ligating fragments into vectors for cloning and expression. CRISPR-Cas9 is a powerful gene-editing tool that allows for precise modification of genomes by targeting specific DNA sequences.
• Applications: These techniques are widely applied in scientific research, medical diagnostics (e.g., detecting infections, genetic mutations), and forensic science (e.g., DNA fingerprinting, paternity testing). Gene editing with CRISPR-Cas9 is also opening new avenues for gene therapy.

¡Claro! Aquí tienes un texto en español basado en el seminario, diseñado para servir como guía de estudio en formato PDF.

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Guía de Estudio: Técnicas de Detección, Amplificación y Manipulación de Ácidos Nucleicos

Seminario 2B - Biología Molecular y Genética FMED - UBA

Profesor: Gabriel Cicolone Colaboradora: Sofía Martín

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Índice

1. Introducción y Objetivos
2. Clasificación General de Técnicas de Ácidos Nucleicos
3. Técnicas Basadas en Hibridación
   • 3.1. Fundamento de la Hibridación
   • 3.2. Aplicaciones: Secuencias Individuales vs. Conjunto Global
   • 3.3. Electroforesis en Gel y Transferencia (Southern Blot, Northern Blot)
   • 3.4. Hibridación in situ
   • 3.5. Hibridación Genómica Comparada (Microarrays)
4. Técnicas de Amplificación y Clonación de Ácidos Nucleicos
   • 4.1. Clonación in vitro (PCR)
     • 4.1.1. Principio y Componentes
     • 4.1.2. Ciclos de PCR y Termociclador
     • 4.1.3. PCR Convencional vs. PCR Cuantitativa (qPCR)
     • 4.1.4. Aplicaciones de la PCR
   • 4.2. Clonación in vivo (Tecnología de ADN Recombinante)
5. Técnicas de Secuenciación de Ácidos Nucleicos
6. Técnicas de Recombinación del ADN
   • 6.1. Enzimas de Restricción y Extremos Pegajosos
   • 6.2. Formación de Moléculas Híbridas (Vectores e Insertos)
   • 6.3. Vectores de Expresión y Producción de Proteínas
   • 6.4. Proteínas Fluorescentes como Marcadores
7. Técnicas de Edición Génica
   • 7.1. CRISPR-Cas9: Principio y Mecanismo
   • 7.2. Edición Génica: Knockout vs. Knock-in
   • 7.3. Aplicaciones Terapéuticas (Terapia Génica)

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1. Introducción y Objetivos

El seminario aborda las técnicas fundamentales para la detección, amplificación y manipulación de ácidos nucleicos (ADN y ARN). Los objetivos principales son:

• Comprender el fundamento y la utilidad de estas técnicas.
• Explicar los principios de funcionamiento y justificar su aplicación en:
  • Análisis del genoma y del transcriptoma (productos de expresión génica).
  • Investigación científica.
  • Medicina asistencial y forense.
• Aplicar estas metodologías para resolver problemas científicos y médico-legales.

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2. Clasificación General de Técnicas de Ácidos Nucleicos

Las técnicas pueden clasificarse según su utilidad y el tipo de proceso:

• Detección de Ácidos Nucleicos: Basadas en hibridación (secuencias individuales o globales).
• Amplificación o Clonación de Ácidos Nucleicos: in vivo (en organismos) o in vitro (en tubos de ensayo).
• Secuenciación de Ácidos Nucleicos: Determinación del orden de nucleótidos.
• Recombinación y Edición del ADN: Modificación y manipulación del material genético.

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3. Técnicas Basadas en Hibridación

3.1. Fundamento de la Hibridación

La hibridación es el proceso de unión de dos cadenas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) por complementariedad de bases (A con T/U, y G con C). Para que ocurra en ADN, las cadenas deben estar separadas (desnaturalizadas), usualmente por calor (aprox. 95°C).

3.2. Aplicaciones: Secuencias Individuales vs. Conjunto Global

• Secuencias Individuales: Identificación de fragmentos específicos de ADN o ARN.
• Conjunto Global: Análisis de todo el genoma (genoma completo) o todo el ARN de un sistema biológico (transcriptoma).

3.3. Electroforesis en Gel y Transferencia (Southern Blot, Northern Blot)

• Electroforesis en Gel: Técnica para separar macromoléculas (ADN, ARN, proteínas) según su tamaño y carga eléctrica mediante un gel poroso y un campo eléctrico. Los ácidos nucleicos, con carga negativa, migran hacia el polo positivo. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápido y se separan mejor.
• Southern Blot:
  1. Fragmentación del ADN genómico con enzimas de restricción.
  2. Separación de los fragmentos por electroforesis en gel de agarosa.
  3. Desnaturalización del ADN (separación de hebras) para permitir la hibridación.
  4. Transferencia (Blotting) del ADN desnaturalizado a una membrana sólida (ej. nitrocelulosa).
  5. Hibridación con una sonda marcada (oligonucleótido complementario a la secuencia de interés).
  6. Detección de la sonda hibridada (ej. con radioisótopos, fluorescencia, enzimas).
  • Utilidad: Detectar la presencia y tamaño de secuencias de ADN específicas en una muestra.
• Northern Blot: Similar al Southern blot, pero se utiliza para analizar ARN. No requiere desnaturalización previa (el ARN es monocatenario) ni corte con enzimas de restricción (se analizan los ARN directamente según su tamaño).
  • Utilidad: Detectar la presencia y tamaño de moléculas de ARN (ej. ARN mensajero) y evaluar su nivel de expresión.
• Western Blot: Técnica análoga para proteínas, utilizando anticuerpos para la detección.

3.4. Hibridación in situ

Permite detectar secuencias de ácidos nucleicos directamente dentro de la estructura celular o tisular (conservando la morfología). La sonda marcada se hibrida con el ácido nucleico diana en su ubicación original.

• Hibridación in situ fluorescente (FISH): Utiliza sondas marcadas con fluorocromos. Muy usada en citogenética para localizar genes en cromosomas o detectar anomalías cromosómicas.
• Hibridación in situ con sondas marcadas con enzimas: La enzima genera un producto coloreado que precipita en el sitio de hibridación, permitiendo la visualización al microscopio. Útil para ver la distribución de ARNm en cortes de tejido (ej. estudio de expresión génica durante el desarrollo embrionario).

3.5. Hibridación Genómica Comparada (Microarrays)

Técnicas que analizan el conjunto global de ácidos nucleicos de un sistema biológico.

• Hibridación Genómica Comparada en Microarrays: Permite comparar el genoma (ADN) o el transcriptoma (ARN) de dos muestras. Se marcan las muestras con diferentes fluorocromos (ej. rojo y verde). Si hay igual cantidad de un fragmento de ADN/ARN en ambas muestras, se observa amarillo (mezcla de rojo y verde). Si predomina una muestra, se verá el color correspondiente (rojo o verde). Permite detectar diferencias en la expresión génica o anomalías genómicas entre dos estados (ej. célula cancerosa vs. normal). Para analizar ARN, se convierte primero a ADN complementario (ADNc).

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4. Técnicas de Amplificación y Clonación de Ácidos Nucleicos

4.1. Clonación in vitro (PCR)

• Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Técnica in vitro para amplificar exponencialmente un segmento específico de ADN.
  • Principio: Se basa en la replicación cíclica del ADN utilizando ADN polimerasas termoestables, cebadores (primers) y desoxirribonucleótidos.
  • Componentes:
    • ADN molde (genómico o ADNc).
    • Primers (cebadores): Oligonucleótidos cortos (ADN) que definen los extremos del segmento a amplificar.
    • ADN Polimerasa termoestable (ej. Taq polimerasa).
    • Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs): Bloques de construcción del nuevo ADN.
    • Buffer con Mg²⁺ (cofactor esencial para la polimerasa).
  • Ciclos de PCR: Cada ciclo consta de 3 pasos controlados por temperatura:
    1. Desnaturalización (93-95°C): Separa las hebras del ADN molde.
    2. Alineamiento/Hibridación (Anneling, 50-70°C): Los primers se unen por complementariedad a las hebras molde.
    3. Extensión/Polimerización (70-74°C): La ADN polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN a partir de los primers.
  • Termociclador: Equipo que realiza los cambios de temperatura cíclicos de forma automática.
  • PCR Convencional (Punto Final): El producto amplificado se visualiza al final de la reacción mediante electroforesis en gel. Permite determinar presencia/ausencia y tamaño del fragmento.
  • PCR Cuantitativa (qPCR / Real-Time PCR): La amplificación se monitoriza en tiempo real mediante un marcador fluorescente (ej. SYBR Green que se une al ADN doble cadena, o sondas específicas tipo TaqMan). La intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN amplificado.
    • RT-qPCR: Si se parte de ARN, se realiza primero una transcripción inversa (RT) para obtener ADNc, y luego se aplica la qPCR. Permite cuantificar niveles de ARN mensajero.
  • Ventajas: Rapidez, alta sensibilidad (amplifica desde cantidades mínimas de ADN), especificidad.
  • Limitaciones: Requiere conocimiento previo de la secuencia para diseñar primers, el tamaño del fragmento a amplificar es limitado (aprox. 50-5000 pb).
  • Aplicaciones: Diagnóstico de infecciones (bacterianas, virales), detección de mutaciones, medicina forense (identificación de individuos, pruebas de paternidad), investigación (clonación de genes, secuenciación).

4.2. Clonación in vivo (Tecnología de ADN Recombinante)

Implica la recombinación de segmentos de ADN y su amplificación dentro de un organismo vivo (generalmente bacterias).

• Pasos:
  1. Cortar un plásmido (vector de ADN circular, autorreplicante) y el gen de interés (inserto) con la misma enzima de restricción.
  2. Unir los fragmentos mediante ligasas para formar una molécula híbrida o recombinante.
  3. Introducir la molécula recombinante en un huésped (ej. bacterias) mediante transformación.
  4. Cultivar las bacterias, que replicarán el plásmido y el inserto, logrando miles de copias.
  5. Purificar el ADN para obtener el inserto amplificado.
• Vectores: Plásmidos, genomas virales, cromosomas artificiales (BAC, YAC). Varían en el tamaño del inserto que pueden portar.
• Vectores de Expresión: Contienen secuencias reguladoras (promotores) que permiten la transcripción y traducción del inserto dentro de la célula huésped, produciendo la proteína codificada.
• Aplicaciones: Producción de proteínas recombinantes (ej. insulina, hormona de crecimiento), desarrollo de vacunas, ingeniería genética (creación de organismos modificados genéticamente).

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5. Técnicas de Secuenciación de Ácidos Nucleicos

• Secuenciación de Sanger: Determina la secuencia de nucleótidos de fragmentos de ADN específicos. Se basa en la terminación controlada de la síntesis de ADN.
• Secuenciación de Nueva Generación (NGS): Permite secuenciar millones de fragmentos de ADN simultáneamente. Es más rápida y económica para secuenciar genomas completos o transcriptomas.

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6. Técnicas de Recombinación del ADN

6.1. Enzimas de Restricción y Extremos Pegajosos

• Enzimas de Restricción: Endonucleasas bacterianas que cortan el ADN en secuencias palindrómicas específicas.
  • Corte: Pueden generar extremos romos (sin sobresalir) o extremos pegajosos (con hebras cortas sobresalientes que pueden unirse por complementariedad de bases).
• Secuencias Palindrómicas: Secuencias de ADN que se leen igual en ambas direcciones (ej. 5'-GAATTC-3' en una hebra y 3'-CTTAAG-5' en la complementaria).

6.2. Formación de Moléculas Híbridas (Vectores e Insertos)

Se combinan fragmentos de ADN de distinto origen (ej. plásmido + gen de interés) utilizando enzimas de restricción y ligasas para crear moléculas de ADN recombinante.

6.3. Vectores de Expresión y Producción de Proteínas

• Vectores de Expresión: Contienen elementos necesarios para la expresión génica (promotores, terminadores) además de las secuencias para la replicación y corte. Permiten producir grandes cantidades de una proteína específica (ej. insulina humana en bacterias).
• Fusión de Genes: Se puede fusionar el gen de interés con otro gen que codifique para una proteína marcadora (ej. proteína fluorescente) para facilitar la identificación y localización de la proteína de interés en la célula.

6.4. Proteínas Fluorescentes como Marcadores

• Proteínas como la GFP (Green Fluorescent Protein) permiten visualizar la expresión génica y la localización celular de proteínas en organismos vivos o cultivos celulares. Se pueden fusionar con proteínas de interés o usarse para marcar células transfectadas.

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7. Técnicas de Edición Génica

7.1. CRISPR-Cas9: Principio y Mecanismo

• CRISPR-Cas9: Sistema de edición génica basado en un complejo de ARN guía y una enzima endonucleasa (proteína Cas9). El ARN guía dirige la proteína Cas9 a una secuencia de ADN específica para realizar un corte de doble cadena.
  • ARN Guía: Molécula sintética diseñada por el investigador para reconocer la secuencia diana del ADN.
  • Proteína Cas9: Endonucleasa que realiza el corte en el ADN.
• Mecanismo de Reparación: Tras el corte, la célula activa mecanismos de reparación del ADN:
  • Unión de Extremos No Homólogos (NHEJ): Proceso propenso a errores que puede generar inserciones/deleciones (indels), llevando a la inactivación del gen (knockout).
  • Recombinación Homóloga (HR): Si se proporciona una molécula molde de ADN (secuencia homóloga), la célula puede usarla para reparar el corte, permitiendo la inserción de secuencias específicas (técnica de knock-in).

7.2. Edición Génica: Knockout vs. Knock-in

• Knockout Génico: Inactivación de un gen mediante la edición génica (ej. CRISPR-Cas9) que introduce mutaciones que impiden su expresión o función. Permite estudiar la pérdida de función de un gen.
• Knock-in: Inserción de una secuencia de ADN específica (ej. un gen normal para reemplazar uno mutado, o un gen mutado para estudiar sus efectos) en un locus genómico determinado, utilizando la recombinación homóloga guiada por CRISPR-Cas9. Permite estudiar ganancia o alteración de función.

7.3. Aplicaciones Terapéuticas (Terapia Génica)

• Terapia Génica: Modificación genética de células de un paciente para tratar enfermedades.
  • Ex vivo: Se extraen células del paciente, se modifican genéticamente (ej. con CRISPR-Cas9) y se reintroducen.
  • In vivo: Se introducen directamente las herramientas de edición génica (ej. ARN guía y Cas9) en el organismo del paciente.
• Beneficios: Potencial para corregir enfermedades genéticas, mejorar la respuesta inmune contra cáncer, etc.

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Nota: Esta guía resume los puntos clave del seminario. Se recomienda la revisión completa de la presentación y el material complementario para un entendimiento profundo.